聚合酶链式反应PCR介绍
2013-02-07 00:00
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。该技术在短时间内可在体外扩增获得大量的目的基因，从而比较容易对目的基因进行分析鉴定，所以已经被广泛应用于分子生物学的各个领域。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：首先模板DNA双链解离成为单链；然后解离成单链的模板DNA与引物的互补序列配对结合；最后DNA模板--引物结合物在聚合酶的作用下，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的DNA模板双链。合成的新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环按2n指数方式递增，故能将目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应具有以下几个特点：1、特异性强：聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使被扩增的靶基因片段能保持很高的正确度。2、灵敏度高：PCR产物能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平。3、简便快速：一次性地将反应液加好后，一般在2～4 小时完成扩增反应，无放射性污染、易推广。4、对标本的纯度要求低，可直接用临床标本如血液、体腔液等DNA扩增检测。
PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态，并且病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。PCR还能应用于肿瘤方面。在许多肿瘤早期和良性的阶段，癌基因的表达增加和突变就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。PCR也能用于遗传学方面，如检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变等。
我院最近引进了实时荧光定量PCR技术，即在常规PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR与常规PCR相比，不仅实现了定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，是目前应用于临床最先进的PCR技术。我院在五邑地区率先引进美国ABI 7500Ⅱ型PCR基因扩增仪，这是目前国际上最先进的第三代扩增仪，可用于绝对定量，相对定量，等位基因分型，阴阳性鉴定。目前PCR实验室主要用于HBV-DNA定量和8种高危型HPV-DNA定量的检测。
PCR实验室的建立，标志着我院跨入了分子诊断水平，使我院检测技术水平有了进一步的提高，同时也能为临床医生和患者提供更优质的检测服务。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：首先模板DNA双链解离成为单链；然后解离成单链的模板DNA与引物的互补序列配对结合；最后DNA模板--引物结合物在聚合酶的作用下，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的DNA模板双链。合成的新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环按2n指数方式递增，故能将目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应具有以下几个特点：1、特异性强：聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使被扩增的靶基因片段能保持很高的正确度。2、灵敏度高：PCR产物能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平。3、简便快速：一次性地将反应液加好后，一般在2～4 小时完成扩增反应，无放射性污染、易推广。4、对标本的纯度要求低，可直接用临床标本如血液、体腔液等DNA扩增检测。
PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10~100基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态，并且病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。PCR还能应用于肿瘤方面。在许多肿瘤早期和良性的阶段，癌基因的表达增加和突变就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。PCR也能用于遗传学方面，如检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变等。
我院最近引进了实时荧光定量PCR技术，即在常规PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR与常规PCR相比，不仅实现了定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，是目前应用于临床最先进的PCR技术。我院在五邑地区率先引进美国ABI 7500Ⅱ型PCR基因扩增仪，这是目前国际上最先进的第三代扩增仪，可用于绝对定量，相对定量，等位基因分型，阴阳性鉴定。目前PCR实验室主要用于HBV-DNA定量和8种高危型HPV-DNA定量的检测。
PCR实验室的建立，标志着我院跨入了分子诊断水平，使我院检测技术水平有了进一步的提高，同时也能为临床医生和患者提供更优质的检测服务。